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压电石英晶体免疫传感器在前列腺特异抗原检测的实验研究


www.szhjd.com 2008年3月28日

        [摘要]  目的  构建一种检测前列腺特异抗原(PSA)的新型压电石英晶体免疫传感器。
    方法 采用AT切型、基频10 MHz的金膜电极石英晶体用金属夹具和乳胶套圈固定形成检测池,抗人nA单克隆抗体采用巯基化方法固定在金膜电极表面制成抗体识别膜,构成压电PSA免疫传感器,同时对56例临床血清标本进行检测,并与化学发光免疫分析法进行比较。
    结果  构建的压电PSA免疫传感器对PSA的响应特性良好,其线性检测范围为1.25-50n9/ml,批内、批间变异系数(CV)分别小于4.0%和6.0%,与化学发光免疫分析法具有良好的相关性(r=0.95,P>0.05),癌胚抗原(CEA)、甲种胎儿球蛋白(AFP)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)等对PSA的检测基本无干扰;传感器可再生后重复使用5次。
    结论  压电PSA免疫传感器具有灵敏度高、特异性好、不需标记、操作简单、省时、能实时在线检测和重复使用等优点,是一种检测PSA的新方法,适用于临床检测,有推广价值。

    免疫测定前列腺特异抗原(prostate speciflc antigen,PSA)是一种仅由前列腺管上皮细胞产生和分泌的前列腺特异性标志物,在前列腺肿瘤、增生时其水平升高,且具有很好的组织特异性。因此,血清PSA的检测是诊断前列腺肿瘤的最佳方法之一。目前,PSA的临床检测方法主要有化学发光免疫分析法、放射免疫分析法、酶联免疫吸附分析法等。这些方法都需要对抗体或抗原进行荧光标记、同位素标记或酶标记,操作繁琐,耗时,检测成本较高。为此,我们以SuUoSaCSinimidyl 6-[3/-(2-pyridyldithio) propionamido)hexanoate(磺基琥珀酰-2-吡啶二硫-3,丙酰氨基6-己酸盐,Sulfo-LC-SPDP)巯基化固定法制备抗人PSA抗体识别敏感膜,构建了一种新的质量效应型压电PSA免疫传感器,并初步应用于临床标本的检测,取得了良好的效果。

    材料和方法
    一、材料
    1、仪器与器材:石英晶振采用AT切型,双面镀金电极,基频10MHz的石英晶体,晶振为13.0mm×13.0mm的方片,金膜电极直径为4.0 mm,晶振两面电极的接触点引在晶振的同一面。检测池固定夹具具有与晶振尺寸相应的固定槽、电极接触膜及电极导线,上盖有直径6.0mm的圆孔,夹具两端用螺丝固定;池壁为直径10mm的乳胶套圈。压电频率检测仪采用自激式振荡电路,频率信号为TYL电平输出,检测室具有恒温、屏蔽、防震装置。PCL-836多功能频率记数卡(台湾研华公司产品)内置于方正奔Ⅲ型计算机(北大方正集团公司)。自行开发的《PESA2.0频率采集分析软件》具有频率记数、差值显示、频率变化趋势图显示等功能。

    2、主要试剂:抗人PSA单克隆抗体购自美国Biodesign公司(浓度为3.0 mg/ml,PBS溶液pH7.0);  Sulfosuccinimidyl6-[3/-(2-pyridyldithio)Provionamido hexanoate(Sulfo-LC-SPDP)为美国
Pierc。公司产品;化学发光免疫检测试剂盒为美国Beckman-Coulter公司原装试剂;人PSA标准品采用化学发光免疫检测试剂盒的标准品,由西南医院检验科黄君富博士惠赠。其他试剂均为AR级。

    二、方法
    1、石英晶体的预处理:按文献[7]报道的方法进行。氮气吹干后备用。
    2、压电石英晶体传感器检测池的组装:把石英晶振放人金属夹具的晶振固定槽中,电极接触点向下放置与外接电极接触,抗体固定面向上,置人乳胶会圈和带金属的固定橡胶条,套上夹具上盖,旋紧固定螺钉,组装成压电石英晶体传感器检测池;外接电极与频率检测仪检测接口连接,频率信号通过PCL-836型数据采集卡进入计算机的频率采集及分析系统。
    3、抗体的巯基化固定方法:抗体溶液3 1Ll与等体积的Sulfo-LC-SPDP溶液混合,室温反应60 min,然后加入25 mmol/L的二硫苏糖醇(DTr)2ul,混匀后室温反应30min。上述巯基化抗体混合液全部转移至石英晶体金膜电极表面,均匀涂布,石英晶体在室温干燥。分别用0.15 moL/L的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 7.4)和双蒸水冲洗3-5次,氮气吹干,4℃冰箱保存备用。
    4、检测方法:检测池置于压电频率检测仪的检测室内,加入0.15mol/L的PBSl00 ul作为检测缓冲液,37℃平衡片刻,检测记录液相基频f1;加入10ul不同浓度的PSA标准溶液或血清样品,继续检测60min,记录频率f2,频率偏移值Af:f1-f2。标准曲线每个浓度点重复3次。血清PSA浓度超过50nR/ml时,需稀释后检测,共检测56例临床标本。

    三、统计学分析:采用SPSSl0.0统计分析软件进行相关分析。并采用t检验和X2检验。

    结果
    一、抗体工作浓度的选择
    为了探讨巯基化法固定抗体时抗体的最适工作浓度,把浓度为3.0 mg/m1的抗体稀释成不同浓度的工作液。观察抗体浓度与抗体固定量的关系。结果表明,巯基化固定抗体的量与抗体工作浓度密切
相关。抗体的固定量随浓度的增加而增大,在抗体浓度达到3.0mg/ml时,抗体的固定量最大。因购买的抗体浓度最高为3.0 mg/ml,无法观察更高浓度。因此,巯基化法固定PSA抗体,抗体工作浓度选择3.0 mg/ml,以下实验均采用这一浓度。

    二、压电PSA免疫传感器的响应特性
    1、温度对传感器的影响:结果与前文报道一致。在37℃时,抗原抗体反应达到平衡的时间最短,且传感器的频率响应最大。当温度继续升高时,传感器的频率响应却反而迅速减小,这可能与温度升高,抗原抗体反应的逆反应速度加快和抗体活性损失有关。
    2、抗原-抗体反应时间对传感器的影响:用制备好的压电免疫传感器检测PSA标准品,在37℃条件下观察晶体振荡频率随抗原-抗体反应时间的变化规律。结果显示,抗原抗体反应在40 min后,频率达到稳定,继续检测,频率降低已不显著。表明抗原抗体反应已达到平衡,免疫反应基本完成,再延长反应时间,抗原抗体反应所致的晶体表面质量负载也无明显变化,频率达到稳定。因此,实验选择40min作为检测PSA的反应时间。
    3、压电PSA免疫传感器检测方法的特异性:用压电PSA免疫传感器检测人绒毛膜促性腺激素(hCG)、癌胚抗原(CEA)、甲种胎儿球蛋白(AFP)高浓度标准溶液,上述条件反应40min后,检测hCG、CEA、AFP所致传感器的非特异性频率响应值分别为14.4±3.4Hz、2.13±2.9 Hz、10.8±2.2Hz。结果表明,上述物质引起的传感器频率响应均在传感器的噪音范围内(14.2±3.5 Hz),对PSA的检测基本无干扰。可见,传感器的选择性较好,特异性高,能满足临床检测的要求。
    4、精密度实验:用Beckman-Coulter公司PSA化学发光免疫分析试剂盒的标准品(高值含PSA 25ng/ml,低值含PSA 5 ns/m1)作为检测样品,重复测定20次,高值、低值批内CV分别为2.85%、3.93%;每天上、下午各测定1次,连续10d,得到批间CV分别为4.56%、5.77%。

    三、压电PSA免疫传感器检测标准曲线的制作压电传感器在PSA各浓度点的频率变化值(Af=f1-f2;F1为检测液相基频)用3次平行检测结果的平均值表示,并用参考检测值进行校正。以PSA标准溶液的浓度为横坐标,频率变化的绝对值(Af)为纵坐标作图,得到PSA压电免疫传感器的检测剂量反应曲线。PSA的浓度在1.25-50ng/ml范围内,PSA的浓度与传感器频率的变化之间呈良好的线性关系,PSA浓度低于1.25 ng/ml时,传感器频率的特异性响应信号易被噪声信号淹没,因此,1.25 ng/ml是传感器的最低检测限。

    四、初步临床应用利用构建的压电PSA免疫传感器(X法)检测了56例临床血清标本。同时,采用化学发光免疫分析法(Y法)进行平行检测,结果经线性相关分析所得散点图。统计结果显示,本法检测结果与化学发光免疫分析法具有良好的相关性(r=0.95,P>0.05)。

    五、压电PSA免疫传感器的再生用过的传感器用8.0 M的尿素再生,再用于PSA检测,结果表明,传感器仍有良好的响应特性,但其响应能力呈逐渐下降趋势。再生5次以后,传感器的响应能力只相当于第1次的70%,下降非常显著。因此,认为压电PSA免疫传感器可以用尿素再生后重复使用,但再生次数不能多于5次。

    讨论
    生物传感器具有操作简便、结果准确、检测快速等特点,因此,近年来获得了迅速的发展,并广泛应用于生物医学、环境监测、食品卫生检验等领域。压电免疫传感器是一种利用石英晶体作为换能器件,把免疫反应的生物学信号转换成易于观察和检测的频率电信号的新型传感检测技术。其工作的理论基础是Sauerbrey推导的质量-频偏方程:Af=-Kjm,通过频率的变化来反映晶体表面微小的质量改变。
    本研究的压电PSA免疫传感器,采用抗PSA的单克隆抗体作为传感器的免疫识别元件,通过免疫反应捕获检测样品中的PSA,并在石英晶体表面形成抗原抗体复合物,引起石英晶体表面质量负载的微小变化,导致压电石英晶体传感器振荡频率的下降,通过频率变化值(丛)来反映样品中PSA的量。前期研究已发现,密度、黏度、pH和离子浓度是影响压电石英晶体传感器液相检测的主要因素,但血清标本稀释50%以上,并用0.15mol/L的PBS作为检测缓冲液,能有效地消除因血清标本加人所致的上述因素的干扰。因此,试验中加入100,0.15mol/L的PBS缓冲液作为检测反应溶液,血清标本加入量为10 ul,稀释10倍左右,基本消除了介质因素的干扰。

    本结果显示,PSA浓度在1.25-50 ng/m1范围内,传感器为PSA有良好的响应能力,检测灵敏度为1.25ng/ml,与化学发光免疫分析法相当。批内、批间CV分别小于4.0%、6.0%,hCG、CEA、AFP等引起的非特异性频率响应均在噪声范围内,应用传感器检测56例临床标本的结果与化学发光免疫分析法具有良好的相关性(r=0.95)。提示压电PSA免疫传感器检测方法的重复性好、特异性高,能用于PSA的定量检测。尿素能使结合的抗原抗体复合物解离,重新暴露抗体的抗原结合位点,压电PSA免疫传感器用尿素再生后能重复使用5次,降低了检测成本,大大增加了传感器的实用性。

    综上所述,压电PSA免疫传感器具有不需标记,操作过程简便,加入标本后不需加入任何试剂;检测时间短,仅需40 min左右,比放免法的时间大大缩短;更重要的是避免了繁琐的标记过程和放免法标记同位素对人体和环境的损害和污染;传感器能重复使用,与化学发光免疫方法相比,检测成本低廉等优点。因此,压电PSA免疫传感器是一种灵敏、特异、简便、环保的分析新方法,在临床PSA检测方面具有一定的优势,有望在临床推广应用。
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作者: 张波  府伟灵  毛琼国  张雪  陈鸣  蒋天伦  俞凡
 
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